1. 预期用途

该面板包括八个单独编码的安瓿，每个安瓿都含有从人类细胞系中提取的冷冻干燥、纯化的基因组 DNA (gDNA)。该面板包括七种材料，每种材料具有不同的 KRAS 密码子 12 或 13 基因型、共有突变百分比和共有突变体以及每个二倍体人类基因组质量的总 KRAS 拷贝数。此外，该组包含七个 KRAS 密码子 12 和 13 基因型中的每一个的 gDNA 纯合野生型材料（材料代码 16/266）。携带感兴趣的 KRAS 突变的材料可以通过应用特定于每种材料的计算来稀释，以产生一系列 KRAS 共有突变百分比的标准。该面板旨在用作校准二级标准、试剂盒和测定的主要标准。这些材料不用作运行控制。

这些材料由外部实验室测试，并显示适合作为下一代测序 (NGS)、Sanger 测序、实时 PCR、焦磷酸测序、数字 PCR (dPCR)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间 (MALDI- TOF) 质谱分析 (MassARRAY®)、KRAS StripAssay®、高分辨率熔解分析 (HRM)、扩增难治突变系统 PCR (ARMS-PCR)、PCR-反向序列特异性寡核苷酸探针技术 (PCR-rSSO)、微测序和限制片段长度多态性分析（RFLP）。

该小组由世界卫生组织 (WHO) 生物标准化专家委员会于 2017 年成立，作为 WHO 第一个基因组 KRAS 密码子 12 和 13 突变国际参考小组，NIBSC 代码 16/2501

.这些材料不得用于任何其他用途。数据分析必须专注于 KRAS。不得尝试识别源材料捐助者。

NIBSC 16/250 基因组KRAS密码子12,13突变（标准品）

2. 注意

该制剂不适用于人类食物链中的人类或动物

对用于制备该组的细胞系进行了测试，通过 PCR 发现 HIV1、HTLV1、HBV 和 HCV 呈阴性。在小组的制备中使用了一种 Epstein Barr 病毒 (EBV) 转化的类淋巴母细胞系。 EBV 是英国危险病原体咨询委员会分类的第 2 类病原体。 EBV 序列可能存在于这些材料中，但 DNA 是使用蛋白质变性和去除的方案制备的，因此可能使病毒失活。

但是，不能消除活病毒存活的可能性。与所有生物来源的材料一样，这种制剂应被视为对健康有潜在危害。应根据您自己实验室的安全程序使用和丢弃它。此类安全程序应包括戴防护手套和避免产生气溶胶。打开安瓿或小瓶时应小心谨慎，以免割伤。

3. 单元

该小组在一项涉及 56 个实验室和 68 种测试方法的国际合作研究中进行了测试。基因型和共识

八种材料中每种材料的突变百分比均来自最一致的方法 NGS 和 dPCR（表 1）。最终用户能够使用基于突变体和总的稀释公式进一步稀释突变体材料（使用野生型 KRAS 密码子 12 和 13 材料 16/266，或另一种校准到材料 16/266 的野生型基因组 DNA） KRAS 拷贝数，为了在可以实现测定校准的较低共有突变百分比范围内达到进一步的标准，请参见下面的第 7 节

4. 内容

生物材料原产国：英国。

该组包含八个单独编码的安瓿，每个安瓿含有大约 5 µg 从人类细胞系中提取的冻干纯化基因组 DNA（材料 16/266 为 25 µg）。使用“盐析”方法提取基因组 DNA，并在冷冻干燥前用 5mg/ml 海藻糖在 Tris-EDTA 缓冲液中稀释。

5. 存储

将所有未开封的冻干材料安瓿存放在 -20°C 或以下。

请注意：由于冻干材料固有的稳定性，

NIBSC 可以在环境温度下运输这些材料。

NIBSC 16/250 基因组KRAS密码子12,13突变（标准品）

6. 开瓶指南

DIN 安瓿瓶有一个“易开”颜色的压力点，窄的安瓿杆在此与较宽的安瓿瓶主体相连。各种类型的安瓿破碎机可商购获得。要打开安瓿，轻轻敲击安瓿以收集底部（标记）端的材料，并按照安瓿破碎器随附的制造商说明进行操作。

7. 材料的使用

在重新配制之前，不应尝试称量冻干材料的任何部分

a。如上文第 6 节所述打开安瓿瓶。

b。在室温下用 100μl 无核酸酶水复溶冻干材料，除了材料 16/266（野生型 KRAS）应用 200μl 无核酸酶水复溶。

C。使用移液器将每个样品转移到无核酸酶管中，确保收集最大可用体积。

d。让材料在室温下复溶 1 小时，然后用移液管充分混合。

e.用 300µl 分子生物学级 1x Tris-EDTA 缓冲液（10mM Tris，1mM EDTA）进一步稀释仅材料 16/266（野生型 KRAS），并用移液管充分混合，使该材料的总体积为 500µl。

F。在 1x Tris-EDTA 缓冲液中，所有样本的 DNA 浓度现在约为 50ng/µl。使用前确认 DNA 浓度。不必担心材料中可能出现的白色斑点。

G。突变型 KRAS 材料可以与材料 16/266（野生型 KRAS）结合以产生任何选定突变百分比的标准品；请参阅附录 I 中的详细信息。

H。将所需的量添加到您的检测中。材料可以进一步稀释（用无核酸酶水或合适的缓冲液），以达到适合您分析的 DNA 浓度。

g。应在同一测定中分析初级和二级标准，以将值分配给二级标准。